Привет, мир!

Добро пожаловать в WordPress. Это ваша первая запись. Отредактируйте или удалите ее, затем начинайте создавать!

Количественный анализ нуклеиновых кислот

После выделения ДНК и/или РНК и до проведения дальнейших исследований необходимо определить их концентрацию, чистоту препаратов и размер молекул. При наличии загрязнений повторно проводят определенные стадии выделения

по

Для определения концентрации ДНК и РНК в растворе наиболее  широко используются 2 метода. Более простым и точным и точным является спектрофотометрический метод, однако он обладает сравнительно малой чувствительностью. Если общее содержание нуклеиновых кислот невелико, то концентрацию ДНК и РНК можно определить по интенсивности их флуоресценции в УФ-свете после окрашивания бромистым этидием 

Спектрофотометрическое определение суммарного содержания нуклеиновых кислот

Работа 1. Определение суммарного содержания нуклеиновых кислот в очищенном образце и чистоты препарата

При постановке измерения образец ДНК разбавляют дистиллированной водой в 40 раз (к 5 мкл раствора ДНК добавляют 195 мл воды). Измерение поглощения при 260 нм проводят в кювете с длиной оптического пути 1 см, используя воду в качестве контроля. Значение концентрации ДНК в исходном растворе (мкг/мл) находят, умножая значение поглощения при длине волны 260 нм на К= 0, 020 (К — молекулярный коэффициент экстинкции)

[ДНК] = A 260 * К

РНК разбавляют водой в 10 раз (к 20 мкл раствора ДНК добавляют 180 мкл воды). Измерение поглощения при 260 нм проводят в кювете с длиной оптического пути 1 см, используя воду в качестве контроля. Значение концентрации РНК в исходном растворе (мкл/мл) находят, умножая значение поглощения при длине волны 260 нм на К = 0,04 (К — молекулярный коэффициент экстинкции

[РНК] = A 260 * К

Определение чистоты препарата ДНК или РНК

Отношение поглощения при длинах волн 260 нм (260 — 280 нм показывает чистоту препарата ДНК или РНК. Препарат считается чистым, если значение отношений 260 / 280 нм приблизительно равно 1,8 для ДНК и 2,8 для РНК. В случае меньших значений показателя 260 — 280 нм препарат содержит большое количество примесей белка, фенола или или иных контаминирующих агентов, имеющих значительное поглощение при 280 нм

ДНК                               РНК

А 260 / А 280 = 1,8      А 260 / А 280 = 2,8

Другим показателем чистоты препарата ДНК или РНК является отношение значений поглощения 260 — 230 нм. В случае чистого препарата это соотношение обычно равно 1,8 — 2,2. Меньшие значения коэффициента 260 / 230 нм свидетельствуют о загрязнении препарата компонентами, которые остаются после процедуры выделения ДНК или РНК 

1, 8 меньше или равно А 26д0 / А 230 меньше или равно 2,2 

Работа 2. Выделение и спектрофотометрическое определение суммарного содержания нуклеиновых кислот

Для изучения природы и свойств нуклеиновых кислот необходимо выделить их из ткани в нативном, по возможности неизменном, состоянии. Обычно этому препятствуют главным образом два обстоятельства: во-первых, крупные молекулы нуклеиновых кислот упакованы в структуры и прочно связаны с другими химическими компонентами клетки, в частности — с белками; во-вторых, в клетках всегда есть активные нуклеазы, заключенные преимущественно вп лизосомах и переходящие в свободное состояние при гомогенизации тканей. Таким образом, при выделении нуклеиновых кислот особое внимание необходимо уделять инактивации нуклеаз, полноте гомогенизации и очистке препарата от сопутствующих примесей (белки, полисахариды, полифосфаты и др)

Методы количественного определения нуклеиновых кислот, основанные на спектрофотометрии в ультрафиолетовой области спектра отличаются высокой чувствительностью и простотой проведения анализа

Необходимым этапом различных методов спектрофотометрического определения нуклеиновых кислот является их экстракция из биологического материала, сопряженная с гидролизом полинуклеотидов. В связи с этим иметь в виду, что из исследуемого материала предварительно удалить свободные нуклеотиды. В основе модификации спектрофотометрического метода определения суммарного содержания нуклеиновых кислот, разработанного А. С. Спириным, лежит экстракция их горячей хлорной кислотой из биологического материала с последующим определением поглощения экстрактов в ультрафиолетовой области спектра при 270 и 290 нм

Исследуемый материал: ткани печени, сердца, скелетной мускулатуры 

Реактивы: HCLCO4 — 0.2 н и 0,5 н растворы

Оборудование: пипетки, центрифужные пробирки, пробки с воздушным холодильником, водяная баня, центрифуга, спектрофотометр, кюветы

Ход работы: Измельченные на холоде навески ткани печени, сердца, скелетной мышцы (100 — 200 мг) помещают в центрифужные пробирки и доливают в каждую по 5 — 10 мл охлажденного 0,2 н раствора хлорной кислоты. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и осадок отделяют центрифугированием на холоде при скорости 5000 об/мин в течение 10 минут. Надосадочную жидкость отбрасывают и осадок повторно отмывают хлорной кислотой. Такая предварительная обработка материала необходима для удаления кислоторастворимых нуклеотидов. После удаления супернатанта к осадку добавляют 5 — 10 мл 0,5 н раствора хлорной кислоты и, закрыв пробирки пробками с воздушным холодильником, нагревают их в кипящей водяной бане в течение 30 минут. Эта процедура обеспечивает количественную экстракцию нуклеиновых кислот из исследуемого материала и их кислотный гидролиз до растворимых фрагментов. Гидролизаты охлаждают и центрифугируют. Гидролизаты из одинаковых тканей объединяют и определяют поглощение на спектрофотометре при 270 и 290 нм против контрольного раствора — 0,5 и раствора хлорной кислоты. При необходимости гидролизаты разводят тем же  раствором

Далее рассчитывают содержание фосфора нуклеиновых кислот в 1 мл исследуемого раствора по формуле:

С мкг Ф н = (А 270 — А 290) / 0,19, 

Где 0,19 — значение дельта А = (А 270 — А 290), которая имеет гидролизат нуклеиновых кислот, содержащий 1 мкг нуклеинового фосфора в 1 мл раствора. При дальнейших расчетах учитывают общий объем гидролизата и разведения. Для пересчета количества нуклеинового фосфора на количество нуклеиновых кислот пользуются средним пересчетным коэффициентом 10,3

С мкг НК = 10,3 С мкг Фн

Рекомендуется проводить дополнительное определение оптической плотности при 260 нм; оптическая плотность при 260 и 270 нм не должна  различаться более, чем + или равно 15%